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MicroRNA通過調控基因表達和基因組穩定性在生物體內及信號轉導途徑中發揮著重要作用。最近的數據表明，利用二代測序方法從生物體液中高通量定量miRNAs為發現各種疾病的生物標志物帶來了希望，這也將有助于促進癌癥的早期診斷。然而，復雜的測序文庫構建過程往往會引入偏倚，并可能掩蓋miRNA的實際表達水平，從而導致錯誤性的結論。

近日，北京化工大學許立達教授課題組在Quantitative Biology期刊上發表了題為“The methodological challenge in high-throughput profiling and quantifying microRNAs”的綜述文章（點擊文末“閱讀原文”下載PDF全文）。文章詳細討論了miRNA測序文庫構建過程中各步驟的偏倚問題，并提出了多種策略以避免或最小化偏倚，從而生產高質量的數據。此外，文章還對多種市售的miRNA文庫制備試劑盒進行了比較。希望本文能為高通量定量分析microRNA的初學者提供幫助。

全文概要

本文首先系統總結了在高通量分析和定量miRNAs過程中所引進的不同來源的偏倚以及優化步驟，并從miRNA文庫制備的每個步驟進行了討論（如圖1）。

由于cDNA文庫制備的眾多步驟可能是結果偏倚的來源，因此研究人員傾向使用多種優化方法建立高質量的測序文庫，以確保高通量分析和定量microRNA結果的準確性。本文介紹了幾種具有代表性的組合優化策略，如TEsR（target enrichment of sRNAs）方法通過引入生物素修飾的RNA探針、優化接頭及使用連接酶來確保稀有sRNAs的檢測及可用的多種形式的sRNAs，但該方法不適合新型sRNAs的研究。QsRNA-seq（Quantitative small RNA sequencing）使用了優化的SPRI和5‘接頭，以及由8個隨機核苷酸組成的UMIs，可以非常準確、全面地定量miRNA。Small-seq與傳統方法相比，它主要是采用了寡核苷酸修飾的rRNA來避免高豐度5.8SrRNA的干擾；lambda外切酶可減少接頭二聚體的形成；5‘接頭UMI可去消除PCR擴增和small RNA分子定量的偏倚，但該方法的偏差會來自3’接頭末端。AQ-seq（accurate quantification by sequencing）方法通過組合應用4個簡并核苷酸和在3‘ 接頭和5‘接頭連接反應中使用20% PEG，可顯著提高miRNA的量，并能檢測到低豐度的miRNA。RealSeq-AC方法通過連接一個單端的3’接頭及環化miRNA-接頭連接產物，從而提高了miRNA定量的準確性。該方法還設計了一種阻斷分子阻止了接頭的自身環化，從而可從1ng總RNA樣品中檢測到miRNA。

此外，本文還將市售的一些low-input miRNA文庫制備的特點進行了對比，如表1。

希望本文對miRNA文庫構建的初學者在實驗設計、試劑盒購買及如何避免實驗偏倚問題提供幫助。

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